Análise microbiológica da água e do ambiente
1. Para avaliação da presença de micro-organismos no ambiente, expor a placa de Petri aberta por tempos diferentes de exposição (5, 10, 15 e 20 minutos).
2. Nas coletas de superfície, umedecer o swab na água peptonada, retirar o excesso na parede do tubo e coletar a amostra do material a ser investigado.
3. Utilizando o swab do material coletado, fazer estrias no meio de cultura (método do esgotamento) e identificar a placa de Petri lateralmente.
4. Incubar as placas em estufa com temperatura de 37°C para o crescimento de bactérias por 24 horas (placas invertidas) ou a 22-25oC por 3-5 dias para o crescimento de fungos (sem inversão).
Procedimentos para análise da água:
1. A amostra de água a ser analisada deve ser coletada obedecendo aos requisitos de não contaminação. Para isso, devem ser utilizados frascos de cultura previamente esterilizados para acondicionamento da amostra. Se a água for coletada de torneiras, deve-se higienizá-las com o auxílio de um swab e álcool 70% e deixar a água fluir durante alguns segundos para somente depois, com uma chama acesa próxima, coletar a amostra de água. O volume de amostra coletado deve ser de aproximadamente 200 mL, para inoculação de 100 mL no meio de cultura.
2. Os meios de cultura necessários à análise devem ser preparados previamente, aliquotados em tubos de ensaio com rolha contendo tubo de Duhram invertido em seu interior e esterilizados em autoclave a 121oC por 15 min. Obs: os meios VB e EMB devem ser fervidos antes da esterilização.
3. As concentrações padrões dos meios de cultura estão especificadas abaixo, entretanto, em análises de água o caldo LST deve ser preparado em concentração dupla. O volume requerido dos meios de cultura é de 10 mL/tubo para o caldo LST e de aproximadamente 5 mL/tubo para os caldos VB e EC. LST: 35,6 g / 1000 mL de água destilada
VB: 40 g / 1000 mL de água destilada
EC: 37 g / 1000 mL de água destilada
EMB: 37,5 g / 1000 mL de água destilada
4. A análise presuntiva de coliformes totais é realizada inoculando-se 100 mL da amostra de água em 10 tubos contendo o caldo LST (10 mL da amostra de água em cada tubo) com o auxílio de uma pipeta estéril e próximo à chama do bico de Bunsen.
5. Os tubos devem ser incubados em estufa a 35-37oC por 24 horas. Caso não haja crescimento, deve-se deixar na estufa até completar 48 horas.
6. O crescimento positivo para coliformes totais é evidenciado pela turvação do meio de cultura e pela presença de bolha retida no tubo de Durham (fermentação da lactose com produção de gás).
7. De cada tubo positivo, inocular uma alçada nos caldos VB (teste confirmativo para coliformes totais) e EC (teste confirmativo para coliformes termotolerantes). Não é necessário flambar a alça de platina entre a inoculação no caldo VB e no caldo EC, mas é indispensável flambá-la entre a inoculação de cada um dos tubos positivos. Incubar os tubos VB em estufa a 35-37oC por 24-48 horas e os tubos EC em banho-maria a 44-45,5oC por 24 horas.
8. O resultado da contagem de coliformes (NMP/100 mL) é obtido pelo valor na tabela de referência do número mais provável de acordo com o número de tubos positivos no caldo VB (coliformes totais) e EC (termotolerantes).
9. De forma opcional, pode-se avaliar o crescimento seletivo e diferencial da Escherichia coli no Agar EMB. Para isso, basta realizar estrias com uma alçada coletada a partir dos tubos positivos no caldo EC. As colônias sugestivas de E. coli apresentam-se com centro negro e brilho verde metálico. Colônias com aspecto mucóide de coloração arroxeada são sugestivas de Enterobacter ou Klebsiella.
9. De forma opcional, pode-se avaliar o crescimento seletivo e diferencial da Escherichia coli no Agar EMB. Para isso, basta realizar estrias com uma alçada coletada a partir dos tubos positivos no caldo EC. As colônias sugestivas de E. coli apresentam-se com centro negro e brilho verde metálico. Colônias com aspecto mucóide de coloração arroxeada são sugestivas de Enterobacter ou Klebsiella.
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